Фазовый контраст

Метод фазового контраста в микроскопии разработан нидерландским физиком Ф. Цернике в 1935 г., на основе которого был создан первый фазово-контрастный микроскоп^[2].

Оптическим контрастом в геометрической оптике называют разность между максимальной ${\displaystyle k}$ и минимальной ${\displaystyle k'}$ освещённостью или светимостью объекта к их сумме (т. н. контрастность Майкельсона):

${\displaystyle \gamma ={\frac {k-k'}{k+k'}}}$,

при этом ${\displaystyle 0\leq \gamma \leq 1}$.

Для оптической системы вводят понятие коэффициент передачи контраста оптической системой:

${\displaystyle \chi ={\frac {k'}{k}}}$.

Для получения более контрастных изображений в традиционной микроскопии используют окрашивание биологических объектов, особенно в медицине и биологии.

Фазовый контраст — один из методов просвечивающей микроскопии, применяющийся в тех случаях, когда показатели преломления или прозрачность исследуемых микроскопических объектов практически не изменяются во всём объёме этих объектов, или их структура такова, что изменения волнового фронта световой волны малы по сравнению с её длиной волны^[3]. Вследствие этого обычные методы просвечивающей микроскопии, основанные на поглощении или рассеянии падающего светового излучения, не позволяют получать контрастные изображения, что затрудняет или делает невозможным анализ исследуемых объектов. Как правило, это прозрачные объекты — стекловидные тела, биологические среды, и т. д.^[4].

Однако, информацию о структуре таких объектов можно получить, исследуя разности фаз различных участков волнового фронта, неизбежно образующиеся при прохождении через полупрозрачные или прозрачные среды. Метод фазового контраста фиксирует фазовый рельеф прошедшего через объект светового излучения, но для его визуализации необходимо преобразование в рельеф амплитудный (который фиксируется органами зрения человека). Для этого используют пропорциональное преобразование разности фаз от различных участков волнового фронта в разность интенсивностей светового излучения, которые легко фиксировать визуально и с помощью измерительных приборов, например, фотометрических.

Фазовый контраст делится на два вида: позитивный фазовый контраст (объект выглядит тёмным на светлом фоне) и негативный (объект выглядит светлым на тёмном фоне) (см. рисунок).

Преимуществом фазово-контрастной микроскопии является то, что она позволяет работать с живыми объектами, что часто невозможно обеспечить другими микроскопическими методами.

В фазово-контрастном микроскопе падающий на образец волновой фронт разделяется на две волны — плоский волновой фронт (неотклонённый, или фронт нулевого порядка), называемый прямой, или ${\displaystyle S}$-волной, и дифрагированной ${\displaystyle D}$-волны. Проходя через образец, обе волны попадают в переднюю линзу объектива, где интерферируют, образуя результирующую ${\displaystyle P}$-волну. В задней фокальной плоскости объектива формируется дифракционная картина, представляющая собой Фурье-преобразование всех пространственных частот, отклонённых и рассеянных исследуемым образцом при использовании фазово-контрастного метода. Конечное изображение, формируемое в переменной плоскости окуляра, является уже обратным преобразованием Фурье. Сопряжённость этих дифракционных картин служит для усиления контраста получаемого изображения, а наличие фазовой пластины позволяет преобразовывать изменения фазы волны в изменения её интенсивности, наблюдаемые визуально. Схема фазово-контрастного микроскопа показана на рисунке 2.

Метод фазового контраста используется, прежде всего, в биологии, медицине, минералогии, геммологии, кристаллографии и др. В биологии и медицине с помощью метода фазового контраста изучают форму, размеры, взаимное расположение клеток, процессы in vivo: размножение, деление, рост, наблюдают споры микроорганизмов, бактерии, вирусы, срезы живых тканей, волокна, субклеточные структуры, и т. д.