Материал из РУВИКИ — свободной энциклопедии

Замкнутая нуклеиновая кислота

Химическая структура мономера LNA: дополнительный мостик связывает 2'-кислород и 4'-углерод пентозы.

Замкнутая нуклеиновая кислота (англ. locked nucleic acid, LNA), также известная как мостиковая нуклеиновая кислота (BNA)[1] и часто называемая недоступной РНК, представляет собой модифицированный нуклеотид РНК, в котором фрагмент рибозы модифицирован дополнительным мостиком, соединяющим 2'-кислородную группу. и 4' углерод. Мостик «запирает» рибозу в 3'- эндо (северной) конформации, которая часто встречается в дуплексах А-формы. Эта структура обеспечивает повышенную устойчивость к ферментативному расщеплению[2][3][4][5]. LNA также предлагает повышенную специфичность и аффинность при спаривании оснований в качестве мономера или компонента олигонуклеотида[6]. Нуклеотиды LNA могут быть смешаны с остатками ДНК или РНК в олигонуклеотиде.

Синтез[править | править код]

Обика и др. были первыми, кто химически синтезировал LNA в 1997 году[7], а в 1998 году независимо друг от друга последовала группа Джеспера Венгеля[8]. Это стало возможным после того, как Замечник и Стивенсон в 1978 году заложили основу для возможности того, что олигонуклеотиды могут быть отличными агентами для контроля экспрессии генов[9]. На сегодняшний день было показано, что два разных подхода, называемые соответственно линейной и конвергентной стратегиями, обеспечивают высокую производительность и эффективность LNA. Линейная стратегия синтеза была впервые подробно описана в работах Обика и др.[7] В этом подходе в качестве исходного материала можно использовать уридин (или любой доступный нуклеозид РНК). Конвергентная стратегия требует синтеза промежуточного сахара, который служит донором гликозила, необходимым для связывания с азотистыми основаниями. Обычно D-глюкоза используется для получения промежуточного сахара, который впоследствии реагирует с азотистыми основаниями с использованием модифицированной процедуры Форбрюгена, позволяющей стереоселективное связывание[10].

Добавление различных фрагментов остается возможным при сохранении ключевых физико-химических свойств, таких как высокое сродство и специфичность, очевидные в первоначально синтезированном LNA[11]. Такие олигомеры синтезируются химическим путем и коммерчески доступны.

Включение в ДНК/РНК[править | править код]

LNA может быть включен в ДНК и РНК с помощью неразборчивости определённых ДНК- и РНК-полимераз. ДНК-полимераза Phusion, коммерчески разработанный фермент, основанный на ДНК-полимеразе Pfu, эффективно включает LNA в ДНК[12].

Характеристики[править | править код]

LNA обеспечивает повышенную биостабильность по сравнению с биологическими нуклеиновыми кислотами. Олигонуклеотиды, модифицированные LNA, продемонстрировали улучшенную термодинамику при гибридизации с РНК, одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК[13].

Применение[править | править код]

LNAзимы[править | править код]

ДНКзимы могут быть модифицированы для включения остатков LNA с образованием LNAзимов (LNA-модифицированных ДНКзимов). Эти модифицированные олигонуклеотиды, как и их родственные ДНКзимы, обычно представляют собой эндонуклеазы, которые связываются со специфическими целевыми последовательностями РНК и расщепляют фосфодиэфирную связь, существующую между нуклеотидами[14]. Однако они демонстрируют более эффективное расщепление фосфодиэфирных связей по сравнению с их немодифицированными аналогами[15]. Модификация плеч распознавания субстрата ДНКзимов мономерами LNA дает LNAзим, который распознает вирус Коксаки A21 (CAV-21) и расщепляет его целевую последовательность РНК, аналогичную последовательности в 5'-нетранслируемой области (5’UTR) риновируса человека −14 (ВСР-14); последовательность, не распознаваемая немодифицированными ДНКзимами[16].

Терапия[править | править код]

Терапевтическое использование олигонуклеотидов на основе LNA является новой областью биотехнологии[17]. Различные олигонуклеотиды LNA были оценены на предмет их фармакокинетических профилей и профилей токсичности. Исследования пришли к выводу, что токсичность LNA обычно не зависит от последовательности олигонуклеотидов и демонстрирует предпочтительный профиль безопасности для переводимых терапевтических применений[11].

LNA был исследован на предмет его терапевтических свойств при лечении рака и инфекционных заболеваний. Заблокированная антисмысловая молекула фосфоротиоата нуклеиновой кислоты, названная SPC2996, была разработана для нацеливания на мРНК, кодирующую онкобелок Bcl-2, белок, который ингибирует апоптоз в клетках хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ). Клинические испытания фазы I и II продемонстрировали дозозависимое снижение циркулирующих клеток ХЛЛ примерно у 30 % выборки, что предполагает дальнейшее изучение SPC2996[18].

LNA также был применен к Miravirsen, экспериментальному терапевтическому средству, предназначенному для лечения гепатита C, представляющему собой 15-нуклеотидную фосфоротиоатную последовательность со специфичностью связывания с MiR-122 (миРНК, экспрессируемая в гепатоцитах)[19][20].

Обнаружение и диагностика[править | править код]

Аллель-специфическая ПЦР с использованием LNA позволяет создавать более короткие праймеры без ущерба для специфичности связывания[21].

LNA был включен в флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH)[22]. FISH — это распространенный метод, используемый для визуализации генетического материала в различных клетках, но исследования показали, что этот метод был ограничен низкой эффективностью гибридизации зондов. Наоборот, зонды с включением LNA продемонстрировали повышенную эффективность гибридизации как в ДНК, так и в РНК . Улучшенная эффективность FISH с включением LNA привела к FISH-анализу хромосом человека, нескольких типов нечеловеческих клеток и микрочипов[22].

Также были проведены анализы генотипирования LNA, специально для обнаружения мутации в аполипопротеине B[23].

Из-за его высокой способности к различению несоответствий LNA был изучен на предмет его применения в диагностических инструментах. Иммобилизованные зонды LNA были введены в мультиплексный анализ генотипирования SNP[24].

Редактирование генов[править | править код]

LNA-модифицированные ssODN (синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды ДНК) можно использовать, как и обычные ssODN, для редактирования генов с одним основанием. Использование LNA в предполагаемом месте модификации или рядом с ним позволяет избежать репарации несоответствия ДНК из-за более высокой термодинамической стабильности, которой он обладает[25].

Использованная литература[править | править код]

  1. Elayadi, Anissa N. (August 2002). “Implications of High-Affinity Hybridization by Locked Nucleic Acid Oligomers for Inhibition of Human Telomerase †”. Biochemistry [англ.]. 41 (31): 9973—9981. DOI:10.1021/bi025907j. ISSN 0006-2960. PMID 12146961. Архивировано из оригинала 2022-09-26. Дата обращения 2022-09-26. Используется устаревший параметр |deadlink= (справка)
  2. Kurreck, J. (2002-05-01). “Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids”. Nucleic Acids Research. 30 (9): 1911—1918. DOI:10.1093/nar/30.9.1911. PMID 11972327.
  3. Frieden, M. (2003-11-01). “Expanding the design horizon of antisense oligonucleotides with alpha-L-LNA”. Nucleic Acids Research [англ.]. 31 (21): 6365—6372. DOI:10.1093/nar/gkg820. ISSN 1362-4962. PMID 14576324.
  4. Frieden, Miriam (October 2003). “Nuclease Stability of LNA Oligonucleotides and LNA-DNA Chimeras”. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids [англ.]. 22 (5—8): 1041—1043. DOI:10.1081/NCN-120022731. ISSN 1525-7770. PMID 14565339. Архивировано из оригинала 2022-06-15. Дата обращения 2022-09-26. Используется устаревший параметр |deadlink= (справка)
  5. Morita, K. (2001-11-01). “2'-O, 4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids (ENA) with nuclease-resistance and high affnity for RNA”. Nucleic Acids Symposium Series [англ.]. 1 (1): 241—242. DOI:10.1093/nass/1.1.241. ISSN 0261-3166. PMID 12836354.
  6. Medicinal chemistry of nucleic acids. — Hoboken, N.J.: John Wiley & Sons, 2011. — 1 online resource с. — ISBN 978-1-118-09280-4, 1-118-09280-5, 978-1-118-09283-5, 1-118-09283-X, 1-283-23990-6, 978-1-283-23990-5, 1-118-09281-3, 978-1-118-09281-1.
  7. 1 2 Obika, Satoshi (1997-12-15). “Synthesis of 2′-O,4′-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3, -endo sugar puckering”. Tetrahedron Letters [англ.]. 38 (50): 8735—8738. DOI:10.1016/S0040-4039(97)10322-7. ISSN 0040-4039.
  8. Orum, Miriam Frieden and Henrik (2008-03-31). “Locked Nucleic Acid Holds Promise in the Treatment of Cancer”. Current Pharmaceutical Design [англ.]. 14 (11): 1138—1142. DOI:10.2174/138161208784246234. PMID 18473860. Архивировано из оригинала 2018-06-09. Дата обращения 2020-10-06. Используется устаревший параметр |deadlink= (справка)
  9. Zamecnik, P. C. (1978-01-01). “Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide”. Proceedings of the National Academy of Sciences [англ.]. 75 (1): 280—284. Bibcode:1978PNAS...75..280Z. DOI:10.1073/pnas.75.1.280. ISSN 0027-8424. PMID 75545.
  10. Koshkin, Alexei A. (2001-12-01). “A Simplified and Efficient Route to 2'-O, 4'-C-Methylene-Linked Bicyclic Ribonucleosides (Locked Nucleic Acid)”. The Journal of Organic Chemistry. 66 (25): 8504—8512. DOI:10.1021/jo010732p. ISSN 0022-3263. PMID 11735531.
  11. 1 2 Orum, Miriam Frieden and Henrik (2008-03-31). “Locked Nucleic Acid Holds Promise in the Treatment of Cancer”. Current Pharmaceutical Design [англ.]. 14 (11): 1138—1142. DOI:10.2174/138161208784246234. PMID 18473860. Архивировано из оригинала 2018-06-09. Дата обращения 2020-10-06. Используется устаревший параметр |deadlink= (справка)Orum, Miriam Frieden and Henrik (2008-03-31). «Locked Nucleic Acid Holds Promise in the Treatment of Cancer» Архивная копия от 9 июня 2018 на Wayback Machine. Current Pharmaceutical Design. 14 (11): 1138—1142. doi:10.2174/138161208784246234. PMID 18473860. Retrieved 2020-10-06.
  12. Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). “Enzymatic Incorporation of LNA Nucleotides into DNA Strands”. ChemBioChem [англ.]. 8 (5): 490—492. DOI:10.1002/cbic.200600501. PMID 17315250.
  13. Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). “Enzymatic Incorporation of LNA Nucleotides into DNA Strands”. ChemBioChem [англ.]. 8 (5): 490—492. DOI:10.1002/cbic.200600501. PMID 17315250.Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (2007-03-26). «Enzymatic Incorporation of LNA Nucleotides into DNA Strands». ChemBioChem. 8 (5): 490—492. doi:10.1002/cbic.200600501. PMID 17315250. S2CID 10206060.
  14. Breaker, R. R. (December 1994). “A DNA enzyme that cleaves RNA”. Chemistry & Biology. 1 (4): 223—229. DOI:10.1016/1074-5521(94)90014-0. ISSN 1074-5521. PMID 9383394. Архивировано из оригинала 2022-09-28. Дата обращения 2022-09-26. Используется устаревший параметр |deadlink= (справка)
  15. Vester, Birte (November 2002). “LNAzymes: Incorporation of LNA-Type Monomers into DNAzymes Markedly Increases RNA Cleavage”. Journal of the American Chemical Society [англ.]. 124 (46): 13682—13683. DOI:10.1021/ja0276220. ISSN 0002-7863. PMID 12431091. Архивировано из оригинала 2022-09-26. Дата обращения 2022-09-26. Используется устаревший параметр |deadlink= (справка)
  16. Schubert, Steffen (May 2004). “Gaining Target Access for Deoxyribozymes”. Journal of Molecular Biology [англ.]. 339 (2): 355—363. DOI:10.1016/j.jmb.2004.03.064. PMID 15136038.
  17. “LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics”. Trends in Biotechnology. 21 (2): 74—81. February 2003. DOI:10.1016/S0167-7799(02)00038-0. PMID 12573856.
  18. Dürig, J. (April 2011). “The novel antisense Bcl-2 inhibitor SPC2996 causes rapid leukemic cell clearance and immune activation in chronic lymphocytic leukemia”. Leukemia [англ.]. 25 (4): 638—647. DOI:10.1038/leu.2010.322. ISSN 1476-5551. PMID 21358717.
  19. Gebert, Luca F. R. (2014-01-01). “Miravirsen (SPC3649) can inhibit the biogenesis of miR-122”. Nucleic Acids Research. 42 (1): 609—621. DOI:10.1093/nar/gkt852. ISSN 0305-1048. PMID 24068553.
  20. Bonneau, E. (2019-06-24). “How close are miRNAs from clinical practice? A perspective on the diagnostic and therapeutic market”. EJIFCC. 30 (2): 114—127. ISSN 1650-3414. PMID 31263388.
  21. Bonetta L (2005). “Prime time for real-time PCR”. Nat. Methods. 2 (4): 305—312. DOI:10.1038/nmeth0405-305.
  22. 1 2 Kubota, Kengo (August 2006). “Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes”. Applied and Environmental Microbiology. 72 (8): 5311—5317. DOI:10.1128/AEM.03039-05. ISSN 0099-2240. PMID 16885281.
  23. Kubota, Kengo (August 2006). “Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes”. Applied and Environmental Microbiology. 72 (8): 5311—5317. DOI:10.1128/AEM.03039-05. ISSN 0099-2240. PMID 16885281.Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (August 2006). «Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes». Applied and Environmental Microbiology. 72 (8): 5311-5317. doi:10.1128/AEM.03039-05. ISSN 0099-2240. PMC 1538721. PMID 16885281.
  24. “LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics”. Trends in Biotechnology. 21 (2): 74—81. February 2003. DOI:10.1016/S0167-7799(02)00038-0. PMID 12573856.Petersen M, Wengel J (February 2003). «LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics». Trends in Biotechnology. 21 (2): 74-81. doi:10.1016/S0167-7799(02)00038-0. PMID 12573856.
  25. van Ravesteyn, TW (12 April 2016). “LNA modification of single-stranded DNA oligonucleotides allows subtle gene modification in mismatch-repair-proficient cells”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15): 4122—7. DOI:10.1073/pnas.1513315113. PMID 26951689.