Окрашивание по Романовскому

Хотя существуют споры о том, кто первым применил эту методику окрашивания, её автором принято считать Дмитрия Леонидовича Романовского^[5].

В 1870-х годах Пауль Эрлих использовал смесь кислых и основных красителей, включая кислый фуксин (кислый краситель) и метиленовый синий (основной краситель), для исследования мазков крови. В 1888 году Чеслав Иванович Чензинский использовал метиленовый синий, но заменил кислый фуксин, который использовал Эрлих, эозином. Комбинация красителей Чензинского смогла окрасить малярийного плазмодия (представителя рода Plasmodium). Ни красители Эрлиха, ни красители Чензинского не дали эффекта Романовского, поскольку используемый ими метиленовый синий не был полихромным^[6][7].

В 1890 году Дмитрий Романовский опубликовал предварительные результаты своего метода окрашивания крови (комбинация выдержанного метиленового синего и эозина), в том числе результаты окрашивания мазков крови больных малярией. Использование полихромного метиленового синего отличало краситель Романовского (и последующие составы) от красителей Эрлиха и Чензинского, которые не давали фиолетового оттенка, связанного с эффектом Романовского. В публикации Романовского 1890 года не было описания того, как он модифицировал свой раствор метиленового синего. Однако в своей докторской диссертации 1891 года он описал использование метиленового синего после того, как на поверхности раствора начала образовываться плесень. За исключением использования выдержанного раствора метиленового синего, краситель Романовского был основан на методике окрашивания Чензинского. Использование Романовским этого метода для изучения малярийного паразита объясняется сохраняющимся интересом к его методу окрашивания^[1][8].

Принято считать, что Эрнст Малаховский независимо от Дмитрия Романовского сделал аналогичное наблюдение той же комбинации красителей. Однако, по другим данным, первенство принадлежит именно Малаховскому. Он первым применил намеренно полихромный раствор метиленового синего, который он получил путём добавления буры к красящей смеси. Сообщается, что Малаховский продемонстрировал этот метод окрашивания 15 июня 1890 года и в том же году опубликовал статью, «описывающую его публичную демонстрацию». Оба метода, Романовского и Малаховского, позволяли окрашивать ядро ​​и цитоплазму малярийного плазмодия, тогда как до этого момента красители окрашивали только цитоплазму^[3][9].

В 1899 году Луи Леопольд Дженнер разработал более стабильную версию красителя метиленового синего и эозина. Для этого он собрал осадок, образующийся в водных смесях, и растворил его в метаноле. Красители типа Романовского, приготовленные из собранного осадка, иногда называют эозинатами. Помимо повышения стабильности красителя, использование метанола в красителе Дженнера приводило к фиксации образцов крови. Несмотря на это вариант окрашивания Дженнера не вызывал эффекта Романовского^[3].

Ричард Май и Людвиг Грюнвальд в 1892 году опубликовали вариант окрашивания (теперь известный как окраска по Май-Грюнвальду), похожий на предложенный Дженнером в 1899 году. Этот вариант также не вызывает эффекта Романовского^[3].

В 1901 году Карл Ройтер и Уильям Лейшман разработали красители, которые сочетали использование Луи Дженнером спирта в качестве растворителя и использование Малаховским полихромного метиленового синего. Краситель Ройтера отличался от красителя Дженнера использованием этилового спирта вместо метанола, а краситель Лейшмана отличался от красителя Дженнера использованием эозина B вместо эозина Y^[3].

В 1902 году Джеймс Гомер Райт опубликовал метод окраски, в котором получал полихромированный метиленовый синий с помощью нагревания. Полученный полихромированный метиленовый синий он комбинировал с эозином Y. Этот метод известен как окраска по Райту^[3].

Имя Густава Гимзы также стало ассоциироваться с этим красителем. Ему приписывают публикацию описания состава и методического протокола в 1902 году. Гимза пытался использовать комбинации чистых красителей, а не полихромные растворы метиленового синего, состав которых сильно варьируется. Гимза продал права на производство своего красителя, но так и не опубликовал полностью подробности его производства. Считается, что он использовал комбинацию лазурного B и метиленового синего. В период с 1902 по 1934 год Гимза опубликовал ряд модификаций своих красителей. В 1904 году он предложил добавлять глицерин к своему красителю наряду с метанолом для повышения его стабильности^[10].

Порошки красителя Гимзы, производимые в Германии, широко использовались в Соединённых Штатах до прекращения поставок во время Первой мировой войны, что привело к расширению использования метода полихромирования метиленового синего Джеймса Гомера Райта^[3].

Диагностическая ценность окраски по Романовскому обусловлена её способностью формировать широкий спектр цветовых оттенков, что обеспечивает чёткую дифференциацию клеточных структур. Это явление известно как эффект Романовского, или в более широком смысле — метахромазия^[11].

Кислый компонент красителя — эозин — отвечает за розово-оранжевую окраску эритроцитов, а также гранул в цитоплазме эозинофильных лейкоцитов. Основные компоненты (производные метиленового синего) окрашивают ядра и другие базофильные структуры^[1].

В 1891 году Д. Л. Романовский разработал метод окрашивания, основанный на смеси эозина (обычно эозина Y) и «выдержанных» растворов метиленового синего. В результате возникали оттенки, нехарактерные для каждого компонента по отдельности, — прежде всего фиолетово-пурпурная окраска хроматина ядра и гранул цитоплазмы некоторых лейкоцитов. Это явление получило название эффекта Романовского^[8].

Было установлено, что ни чистый метиленовый синий, ни эозин (по отдельности или в комбинации) не вызывают этот эффект. Активными компонентами, ответственными за него, считаются азур B и эозин, образующие комплексные соединения с клеточными структурами^[1].

Красители романовского типа могут изготавливаться либо из смеси чистых красителей, либо из метиленового синего, подвергнутого окислительной деметилизации. В результате этого процесса метиленовый синий распадается на ряд производных, необходимых для возникновения эффекта Романовского. Такой препарат известен как полихромированный метиленовый синий. Он может содержать до 10-11 красителей, включая метиленовый синий, азур A, азур B и азур C, тионин, метиленвиолет и другие производные. Точный состав зависит от метода получения, условий окисления и даже партии препарата, что объясняет вариабельность результатов окрашивания^[12].

Распространённый способ ускоренной полихромации заключается в повышении pH раствора (например, добавлением карбоната калия) и нагревании, что способствует окислению за счёт кислорода воздуха. Использовались и альтернативные методы, включая окисление в кислой среде. Хотя было показано, что азур B и эозин являются необходимыми компонентами для получения эффекта Романовского, эти красители в чистом виде не всегда использовались в рецептуре растворов для окрашивания. Первоначальными источниками азура B (одного из продуктов окисления метиленового синего) были полихромные растворы метиленового синего, которые обрабатывались окислителями или выдерживались естественным образом в случае эффекта Романовского. Эрнст Малаховский в 1891 году первым целенаправленно полихромировал метиленовый синий для использования в окрашивании типа Романовского^[13].

Окрашивание по Райту используется самостоятельно или в комбинации с окраской по Гимзе (окраска по Райту-Гимзе). Окрашивание по Райту названо в честь Джеймса Гомера Райта, который в 1902 году опубликовал метод получения полихромного метиленового синего с помощью нагревания^[14]. Согласно методике Райта полихромный метиленовый синий соединяют с эозином и дают ему выпасть в осадок. При этом образуется эозинат, который затем растворяют в метаноле. Добавление красителя Гимзе к окрашиванию по Райту увеличивает яркость «красновато-фиолетового» цвета цитоплазматических гранул. Окрашивание по Райту и окрашивание по Райту-Гимзе — это два метода окрашивания по типу Романовского, широко используемых в Соединённых Штатах, в основном для окрашивания мазков крови и костного мозга^[15].

Окрашивание по Дженнеру применяется в микроскопии мазков крови. Даёт интенсивную синюю окраску ядер, но не обеспечивает полноценного эффекта Романовского^[16].

Краситель по Гимзе состоит из «азура II» (смесь азура B и метиленового синего), эозина Y, метанола и глицерина в качестве растворителя. Считается, что «Азур II» представляет собой смесь азура B (который Гимза называл «азуром I») и метиленового синего, хотя точный состав «азура I» считается коммерческой тайной. Аналогичные составы с использованием известных красителей были опубликованы и доступны в продаже. Считается золотым стандартом для диагностики малярии, а также широко используется в цитогенетике и паразитологии^[17]. Аналогичные составы с использованием известных красителей были опубликованы и доступны в продаже. Метод окрашивания по Гимзе считается стандартным для обнаружения и идентификации малярийного плазмодия^[18].

Окрашивание по Май-Грюнвальду часто применяется совместно с окраской по Гимзе (метод окрашивания по Май-Грюнвальду-Гимзе), особенно в цитологии и гистопатологии для определения опухолевых клеток^[19].

Комбинация методов Май-Грюнвальда и Гимзы, используется для детальной оценки клеточного состава крови^[19].

В 1901 году Уильям Лейшман разработал краситель, похожий на краситель Луиса Дженнера, но с заменой чистого метиленового синего на полихромный метиленовый синий. Краситель Лейшмана получают из эозината полихромного метиленового синего и эозина Y, используя метанол в качестве растворителя^[20].

Метод окрашивания по Филду используется для окрашивания толстых мазков крови с целью обнаружения малярийных плазмодиев^[21].

Красители романовского типа широко используются при морфологическом исследовании мазков периферической крови, аспиратов и биоптатов костного мозга. Они играют ключевую роль в диагностике анемий, лейкозов, миелодиспластических синдромов и воспалительных заболеваний крови. В Соединённых Штатах широко используются варианты окрашивания по Романовскому, такие как окрашивание по Райту и Райту-Гимзе, тогда как в Европе обычно применяется окрашивание по Гимзе^[22].

Окраска по Гимзе является основным методом визуализации Plasmodium spp. в мазках крови. Несмотря на развитие иммунологических и молекулярных методов, микроскопия остаётся эталонным диагностическим подходом во многих регионах^[23].

Методы романовского типа применяются для окрашивания пунктатов тонкоигольной аспирации, ликвора и других цитологических препаратов^[4].