Цитохром-bc1-комплекс

В состав комплекса из митохондрий сердца быка (мол. масса ~ 248 кДа) входит порядка 11 белковых субъединиц, 8 из которых представляют собой мелкие гидрофобные мембранные белки с неизвестной (возможно, структурной) функцией. Бактериальные цитохромные комплексы могут содержать всего от 6 до 8 или даже 3 субъединицы^[3]. Три главные субъединицы несут простетические группы. Цитохром b, в составе которого есть два гема b-типа с разными редокс-потенциалами: гем b_L низким (Е°’~ —0,075…0,00 В) и гем b_H с высоким (Е°' ~ — +0,05 В) потенциалом. Цитохром с₁ несёт простетическую группу, гем типа-с (Е°' -+0,23…+0,25 В). Железосерный белок Риске имеет в своём составе 2Fe-2S-центр (Е°' ~ +0,28 В). Известно, что in vivo комплекс функционирует как димер^[2].

Комплекс погружён во внутреннюю митохондриальную мембрану таким образом, что функциональная группа белка Риске и цитохрома с выходят в межмембранное пространство, тогда как два гема цитохрома b находятся в толще мембраны, причём b_p приближен к её внутренней стороне, а b_n — к наружной. Такое асимметричное расположение редокс-центров в мембране обеспечивает существование двух пространственно разделённых цепей транспорта электронов внутри одного комплекса. Первая, низкопотенциальная цепь транспорта электронов формируется за счёт двух гемов цитохрома b₆ — низкопотенциального b_L и высокопотенциального b_H. Вторая, высокопотенциальная цепь включает белок Риске и гем цитохрома c. При окислении убиохинолов в цитохромном комплексе реализуется два сопряжённых потока электронов — по низкопотенциальному и высокопотенциальному пути^[4].

Данные рентгеноструктурного анализа, позволяющие определить положение активных групп относительно друг друга, а также эксперименты с ингибиторами дали возможность понять, что электронный транспорт возможен не только между двумя гемами одного комплекса, но и между двумя гемами b_L, расположенными на разных комплексах, ассоциированных в димер^[5].

У позвоночных bc₁-комплекс, или Комплекс III, состоит из 11 субъединиц: 3 каталитических субъединиц, 2 коровые субъединицы и 6 низкомолекулярных субъединиц^[6][7]. Протеобактериальные комплексы могут состоять всего из трёх субъединиц^[8].

У растений Комплекс III бифункционален. Недавние исследования на митохондриях пшеницы (Triticum aestivum), картофеля (Solanum tuberosum) и шпината (Spinacia oleracea) показали, что две коровые субъединицы комплекса, обращенные в матрикс, обладают MPP (англ. Mitochondrial Processing Peptidase) — пептидазной активностью и принимает участие в транспорте белков в митохондрии^[9][10].

MPP-пептидаза — это гетеродимер, который состоит из субъединиц α-MPP и β-MPP, каждая весом 50 кДа. Она отрезает у поступающих в митохондрию белков N-концевую сигнальную или транзитную последовательность из 40-80 аминокислот. В растениях MPP-пептидаза входит в состав цитохром-bc₁-комплекса, что считается архаичным признаком. У животных произошла дупликация генов коровых субъединиц, так что MPP-пептидаза у них присутствует как независимый водорастворимый белок матрикса. Коровые субъединицы цитохром-bc₁-комплекса тем не менее не утратили пептидазой активности, однако в составе bc₁-комплекса она блокируется 9-й субъединицей, которая образуется в результате процессинга белка Риске. Тем не менее опыты с бычьим цитохром-bc₁-комплексом показали, что при воздействии детергентов и диссоциации 9-й субъединицы коровые субъединицы вновь приобретают пептидазную активность^[11].

• ^a У позвоночных сигнальный N-концевой пептид белка Риске массой 8 кДа сохраняется в комплексе как субъединица 9. Субъединицы 10 и 11 у человека соответствуют QCR9p и QCR10p у грибов.

TTC19 — недавно открытая малая субъединица комплекса; мутации в ней приводят к недостаточности комплекса III 2-го типа.

Цитохром-bс₁-комплекс окисляет восстановленный убихинон и восстанавливает цитохром c (Е°'=+0,25 В) согласно уравнению:

QH₂ + 2 цит. с⁺³ + 2Н⁺_in →Q + 2 цит. с⁺² + 4H⁺_out

Электронный транспорт в комплексе сопряжён с переносом протонов из матрикса (in) в межмембранное пространство (out) и генерацией на мембране митохондрий протонного градиента. На каждые два электрона, проходящие по цепи переноса от убихинона до цитохрома с, два протона поглощается из матрикса, и ещё четыре высвобождаются в межмембранное пространство. Восстановленный цитохром c движется вдоль мембраны в водной фракции и переносит один электрон к следующему дыхательному комплексу — цитохромоксидазе^[12][13].

События, которые при этом происходят, известны как Q-цикл, который был постулирован Питером Митчеллом в 1976 году. Принцип Q-цикла состоит в том, что перенос Н⁺ через мембрану происходит в результате окисления и восстановления хинонов на самом комплексе. При этом хиноны соответственно отдают и забирают 2Н⁺ из водной фазы избирательно с разных сторон мембраны.

В структуре комплекса III есть два центра, или два «кармана», в которых могут связываться хиноны. Один из них, Q_out-центр, расположен между железосерным кластером 2Fe-2S и гемом b_L вблизи внешней (out) стороны мембраны, обращённой в межмембранное пространство. В этом кармане связывается восстановленный убихинон (QH₂). Другой, Q_in-карман, предназначен для связывания окисленного убихинона (Q) и расположен вблизи внутренней (in) стороны мембраны, контактирующей с матриксом.

Первая часть Q-цикла

1. QH₂ связывается в Q_out-сайте, окисляется до семихинона (Q•) железосерным центром белка Риске и отдаёт два протона в люмен.
2. Восстановленный железосерный центр передаёт один электрон на пластоцианин через цитохром c.
3. Q связывается в Q_in-сайте.
4. Q• передаёт электроны к гему b_L цитохрома b по низкопотенциальной ЭТЦ.
5. Гем b_L передаёт электрон на b_H.
6. Гем b_H восстанавливает Q до состояния Q•.

Вторая часть Q-цикла

1. Второй QH₂ связывается с Q_out-сайтом комплекса.
2. Пойдя по высокопотенциальной ЭТЦ, один электрон восстанавливает ещё один пластоцианин. Ещё два протона поступают в люмен.
3. По низкопотенциальной ЭТЦ электрон от b_H передаётся на Q•, и полностью восстановленный Q²⁻ связывает два протона их стромы, превращаясь в QH₂.
4. Окисленный Q и восстановленный QH₂ диффундируют в мембрану^[14].

Необходимым и парадоксальным условием работы Q-цикла является тот факт, что время жизни и состояние семихинонов в двух центрах связывания разное. В Q_out-центре Q• нестабилен и действует как сильный восстановитель, способный отдать е^- на низкопотенциальный гем by. В Q_in-центре образуется относительно долгоживущий Q•⁻, потенциал которого позволяет ему действовать в качестве окислителя, принимая электроны с гема b_H. Ещё один ключевой момент Q-цикла связан с расхождением двух электронов, входящих в комплекс, по двум разным путям. Изучение кристаллической структуры комплекса показало, что позиция 2Fe-2S-центра относительно других редокс-центров может смещаться. Оказалось, что белок Риске имеет подвижный домен, на котором собственно и расположен 2Fe-2S-кластер. Принимая электрон и восстанавливаясь, 2Fe-2S-центр меняет своё положение, отдаляясь от Q_out-центра и гем b_L на 17 Å с поворотом на 60° и тем самым приближаясь к цитохрому c. Отдав электрон цитохрому, 2Fe-2S-центр, наоборот, сближается с Q_out-центром для установления более тесного контакта. Таким образом, функционирует своеобразный челнок (шаттл), гарантирующий уход второго электрона на гемы b_L и b_H. Пока это единственный пример, когда электронный транспорт в комплексах связан с подвижным доменом в структуре белка^[15].

Небольшая часть электронов покидает цепь переноса до того как достигнет Комплекса IV. Постоянные утечки электронов на кислород приводят к образованию супероксида. Эта небольшая побочная реакция приводит к образованию целого спектра активных форм кислорода, которые весьма токсичны и играют значительную роль в развитии патологий и старении (см. свободнорадикальная теория старения)^[16]. Электронные протечки в основном происходят в Q_in-сайте. Этому процессу способствует антимицин A. Он блокирует гемы b в их восстановленном состоянии не давая им сбросить электроны на семихинон Q•, что в свою очередь приводит к повышению его концентрации. Семихинон реагирует к кислородом, что и приводит к образованию супероксида. Образовавшийся супероксид поступает в митохондриальный матрикс^[17][18] и межмембранное пространство, откуда он может попасть в цитозоль^[17][19]. Этот факт можно объяснить тем, что Комплекс III, возможно, производит супероксид в форме незаряженного HOO^•, которому легче проникнуть сквозь внешнюю мембрану по сравнению с заряженным O₂•^-[18].

Все ингибиторы Комплекса III можно разделить на три группы:

• Антимицин A связывается с Q_in-сайтом и блокирует транспорт электронов от гема b_H к окисленному убихинону Q (ингибитор Q_in-сайта).
• Миксотиазол и стигмателлин связываются с Q_uot-сайтом и блокируют перенос электрона с восстановленного QH₂ на железосерный кластер белка Риске. Оба ингибитора связываются с Q_uot-сайтом, но в разных, хотя и перекрывающихся, местах.
  • Миксотиазол связывается ближе к гему b_L и потому именуется «проксимальным» ингибитором.
  • Стигмателлин связывается дальше от гема b_L и ближе к белку Риске, с которым он взаимодействует.

Некоторые из этих веществ используются как фунгициды (например, производные стробилурина, наиболее известным из которых является азоксистробин, ингибитор сайта Q_out) и противомалярийные препараты (атовакуон)^[20].

Мутации в генах Комплекса III обычно приводят к непереносимости физических упражнений^[21][22]. Другие мутации могут вызывать септо-оптическую дисплазию^[23] и мультисистемные расстройства^[24]. Мутации в гене BCS1L, ответственном за правильное созревание Комплекса III, может привести к синдрому Бьёрнстада и синдрому GRACILE, который приводит к смерти в раннем возрасте. Фенотип многих из этих, а также других мутаций удалось оценить на таких системах как дрожжи^[25].

В какой степени эти патологии вызваны биоэнергетической недостаточностью, а в какой избыточным образованием активных форм кислорода, на данный момент неизвестно.