Такахаси, Джозеф

Исследования Такахаси привели к пониманию того, как циркадные часы млекопитающих влияют на физиологию и отношения с окружающей средой. В 1993 году Такахаси и Майкл Гринберг изучали механизмы вовлечения супрахиазматических ядер млекопитающих в циклы освещения окружающей среды. Они исследовали взаимосвязь между фосфорилированным белком, связывающим элемент ответа на циклический аденозинмонофосфат (CREB), и транскрипцией c-fos, белка, ранее указанного как компонент пути светового вовлечения^[8]. Используя иммунопреципитацию, Такахаси и Гринберг смогли показать, что индуцированное светом фосфорилирование CREB происходит только в течение субъективной ночи^[9]. Учитывая, что CREB регулирует транскрипцию c-fos в клетках феохромоцитомы PC12^[10], Такахаси и Гринберг пришли к выводу, что фосфорилирование CREB в СХЯ может играть важную роль в световом вовлечении млекопитающих^[9].

После исследований in vitro на системе культуры шишковидной железы, используемой для понимания циркадных колебаний, ограничения системы культуры клеток стали очевидны, и Такахаси сменил методы, чтобы начать использовать прямую генетику и позиционное клонирование для понимания генетических и молекулярных основ циркадных ритмов^[1][11]. Используя мутировавшие штаммы мышей, Такахаси и его коллеги выделили штаммы с аномальной длиной периода и открыли ген clock в 1994 году^[12]. Они клонировали циркадный ген clock млекопитающих в 1997 году^[1][13].

В 2000 году Такахаси клонировал мутантный ген tau, идентифицированный в 1988 году Менакером и Мартином Ральфом^[1]. С момента его открытия в 1988 году ген tau был тщательно изучен, однако из-за ограниченных геномных ресурсов у хомяков, организма, в котором он был обнаружен, существовала проблема, препятствующая дальнейшему изучению. С помощью генетически направленного репрезентативного разностного анализа (GDRDA) были выявлены фрагменты ДНК, которые различались между мутантными и дикими хомяками. С этой информацией Такахаси затем использовал позиционное синтеническое клонирование для выявления синтении с геномом человека. Это показало, что ген тесно связан с геном doubletime (dbt) у Drosophila и казеинкиназой 1 эпсилон (CKIe) у людей, оба из которых взаимодействуют с уровнями PER и регулируют их^[14].

С момента идентификации мутанта clock в 1994 году^[12] Такахаси продолжил свои исследования этой мутации и применил её к изучению клинических расстройств, таких как нерегулярный гомеостаз сна и ожирение^[15][16].

В 2000 году он и его коллеги из Северо-Западного университета признали, что мутантные мыши clock спали на 1-2 часа меньше за ночь, чем мыши дикого типа. Кроме того, поскольку у этих мышей отсутствует циркадная система, регулирующая консолидированный сон в определённое время суток, сон у мутантов clock распределяется в течение дня как в циклах свет-темнота, так и в полной темноте. Эта мутация приводит к меньшему количеству быстрого сна и большему количеству времени, проведённому на более ранних стадиях сна.

В 2005 году он сотрудничал с Джозефом Бассом и сообщил о влиянии мутаций в гене clock на метаболизм и физиологию мышей. Их эксперименты сравнивали увеличение веса у мутантных мышей Clock с контрольными мышами и показали, что мутантные мыши с большей вероятностью набирали вес. Такое открытие побудило их продолжить изучение роли гена clock в аппетите и энергии. У мутантных мышей Clock они сообщили о снижении уровня орексина, нейропептида, участвующего в регуляции питания. Этот результат предоставляет дополнительные доказательства того, что ген clock оказывает глубокое влияние на метаболические процессы у мышей^[16].

С тех пор было обнаружено, что сам метаболизм играет роль в регуляции часов^[17]. В 2009 году Джозеф Басс в сотрудничестве с группой Такахаси обнаружил, что опосредованный никотинамидфосфорибозилтрансферазой (NAMPT) синтез метаболического кофермента никотинамидадениндинуклеотида (NAD⁺), которые колеблются в суточном цикле, может играть важную роль в регуляции циркадной активности^[17]. Измеряя колебания уровней NAMPT и NAD⁺ в печени как дикого типа, так и мутантных мышей, они определили, что колебания NAMPT регулируют NAD⁺, который, в свою очередь, регулирует деацетилазу SIRT1^[17].

Использование скринингов мутагенеза (прямая генетика) позволило обнаружить как мутантную мышь clock^[13], так и мутантного хомяка tau^[1]. Лаборатория Такахаси продолжила использование этого метода, чтобы привести к открытиям роли циркадных часов в зрении, обучении, памяти, стрессе и зависимости, среди других поведенческих свойств^[1].

В 2007 году Такахаси и его коллеги из Северо-Западного университета провели прямой скрининг мутагенеза у мышей в поисках вариаций циркадных колебаний и впоследствии идентифицировали мутанта, которого они назвали overtime (Ovtm)^[18]. Используя позиционное клонирование, генетическую комплементацию и гибридизацию in situ, Такахаси и коллеги обнаружили, что Ovtm была точечной мутацией, которая вызывала потерю функции в FBXL3 — F-box белке — и экспрессировалась по всему мозгу и в СХЯ. Анализируя экспрессию известных генов циркадных часов у мутантов Ovtm, они наблюдали заметное снижение уровней белка и мРНК PER1 и PER2 в мозге и значительное снижение только уровней мРНК cry2^[18]. Такахаси и его коллеги предположили, что FBXL3 является сайтом-мишенью для деградации белка на белке CRY2, что объяснило бы относительно нормальные уровни белка CRY2. Отрицательная обратная связь со стороны других элементов циркадных часов могла бы затем привести к примерно 26-часовому периоду свободного хода, наблюдаемому у мышей Ovtm^[18].