В XVII—XVIII веках территория современной епархии входила в состав Воронежской епархии. 5 апреля 1829 года из её состава выделена Новочеркасская и Георгиевская епархия с центром в Новочеркасске. Первоначальным титулом правящего архиерея был «Донской и Кавказский». 17 июля 1842 года из состава Новочеркасской была выделена Кавказская епархия — на землях Черноморского казачьего войска и Северного Кавказа. Новочеркасская и Георгиевская епархия была переименована в Донскую и Новочеркасскую, её границы стали совпадать с границами Области войска Донского. Ростов-на-Дону с уездом и Таганрог, переданные в 1888 году из Екатеринославской губернии в Область войска Донского, оставались в составе Екатеринославской епархии.
В 1911 году было учреждено Таганрогское викариатство Екатеринославской епархии. 24 мая 1919 года решением Юго-Восточного Русского Церковного Собора викариатство преобразовано в самостоятельную Ростовско-Таганрогскую епархию с пребыванием епископа Ростовского и Таганрогского в Ростове-на-Дону. Первым архиереем епархии был назначен епископ Арсений (Смоленец)[1][2].
В начале 1920-х годов, после установления на Дону советской власти, начались гонения на церковь. Была создана комиссия по проведению в жизнь Декрета «Об отделении церкви от государства и школы от церкви», деятельность которой, в частности, была направлена на закрытие храмов. К 1923 году в Ростове было закрыто 7 церквей.
В 1930-е годы советскими властями повсеместно осуществлялось массовое закрытие и разрушение храмов, уничтожение и осквернение святынь, были репрессированы и убиты многие священнослужители. В 1936 году епархиальные управления обеих епархий фактически прекратили свое существование. В 1937 году был закрыт Ростовский кафедральный собор. К концу 1930-х на территории Ростовской области были закрыты все приходские церкви и монастыри.
В годы Великой Отечественной войны церковная жизнь в Ростовской области возродилась. После окончания оккупации 10 августа 1943 года епископом Ростовским стал Елевферий (Воронцов). Границы Ростовской и Таганрогской епархии были соотнесены с образованной в 1937 году Ростовской областью, включившей в себя значительную часть бывшей Области войска Донского и, соответственно, Донской и Новочеркасской епархии.
В 1948 году по инициативе епископа Сергия (Ларина) Ростовская и Таганрогская епархия получила наименование Ростовская и Новочеркасская, которое носила до 2011 года[3].
27 июля 2011 года из Ростовской-на-Дону епархии выделены Шахтинская и Волгодонская епархии[4]. 6 октября 2011 года в пределах Ростовской области была образована Донская митрополия, включающую в себя Волгодонскую, Ростовскую-на-Дону и Шахтинскую епархии[5].