Мануэлидис, Лора

В начале карьеры Мануэлидис открыла неизвестные мотивы последовательностей ДНК. Она продемонстрировала их мегабазную организацию в метафазных хромосомах и интерфазных ядрах. Мануэлидис использовала рестриктазы на цельной ДНК человека и извлекала специфические полосы из геля. Этот подход ранее не применялся для целых геномов млекопитающих. Она обнаружила сложные повторяющиеся (альфа-сателлитные) последовательности ДНК человека и локализовала их в центромерах^[1][2]. Они оказались гомологичны обезьяньим, но не более простым мышиным центромерным повторам^[3]. Эти поздно реплицирующиеся последовательности содержат мало генов или не содержат их вовсе. Они определяют все центромеры хромосом человека, что было показано с помощью гибридизации in situ высокого разрешения^[4].

Как и в других клетках млекопитающих, центромеры необходимы для правильного расхождения хромосом между двумя дочерними клетками во время митоза. Открытие и локализация этих сателлитных последовательностей облегчили диагностику трисомии и хромосомных аберраций при генетических заболеваниях и опухолях.

Мануэлидис также открыла, выделила и секвенировала длинные диспергированные повторы L1 человека (LINES). Она показала, что они содержат транскрипционную открытую рамку считывания^[5]. Мануэлидис обнаружила, что эти многочисленные повторы L1 сконцентрированы в тёмных полосах Гимзы на плечах хромосом, содержащих множество тканеспецифичных генов^[6]. Короткие повторы ALU, напротив, концентрируются в светлых полосах с большинством генов домашнего хозяйства.

Повторы L1 консервативны в эволюции и демонстрируют 70-процентную гомологию с мышиными повторами L1. После секвенирования ретровирусного ВИЧ исследователи пришли к выводу о ретровирусной природе повторов L1. Выяснилось, что эти древние крупные ретровирусные элементы проникли в геном и в ходе эволюции претерпели симбиотическую трансформацию. Они приобрели структурную и, возможно, функциональную роль в мегабазных доменах хромосомных полос. Огромные размеры доменов, богатых L1 и ALU, были также продемонстрированы с помощью электрофореза в пульсирующем поле^[7].

Дополнительные эндогенные ретровирусные ДНК также интегрированы в специфические участки хромосом^[8]. К ним относятся ДНК, продуцирующие ретровирусные внутрицистернальные А-частицы (IAP) у грызунов, а также менее многочисленные эндогенные ретровирусные повторы человека. Это ставит под сомнение предположение о том, что повторяющиеся ДНК являются паразитическим «мусором».

Мануэлидис положила начало изучению трёхмерной структуры хромосом в интерфазном ядре дифференцированных клеток. Она объединила метод оптических серийных срезов и гибридизацию in situ высокого разрешения для специфических последовательностей ДНК. Эти исследования изменили представление об интерфазных ядрах. Ранее интерфазные компартменты рассматривались как плохо очерченные плотные гетерохроматиновые сгустки рядом с неорганизованным эухроматиновым хроматином без связной трёхмерной структуры. В дифференцированных нейронах были продемонстрированы чёткие паттерны расположения отдельных центромер для каждого подтипа нейронов. Эти позиции консервативны в эволюции, хотя центромерные повторы ДНК видоспецифичны. Отслеживание движения X-хромосомы в крупных нейронах при эпилепсии и движения центромер в ходе постмитотического развития нейронов^[9] позволило выявить динамические изменения крупных хромосом. Картирование целых отдельных хромосом человека с высоким разрешением в гибридных клетках мыши и хомяка показало, что каждая хромосома компактна и занимает собственное пространство или «территорию»^[10].

Архитектурная модель перехода хромосом от метафазы к интерфазе соответствует известной компактизации ДНК в диплоидных клетках. Она допускает быстрые переходы и расхождение во время митоза, а также локальные расширения для транскрипции^[11]. Картирование целых отдельных хромосом с использованием гибридизации ДНК высокого разрешения из хромосомоспецифичных библиотек впоследствии помогло в изучении хромосомных изменений при сложных генетических заболеваниях и прогрессировании опухолей. Внедрение крупного 11-мегабазного трансгена глобинового экзона (без интронов) распознавалось клетками. В нейронах он подавлялся путём компактизации вместе с транскрипционно инертными гетерохроматиновыми центромерами^[12]. Это показывает, что непрерывные повторы способны вызывать специфические функциональные и структурные изменения во время интерфазы. Вероятно, эта особенность последовательно проявляется в процессе дифференцировки клеток.

Лаборатория Э. Э. Мануэлидиса и Л. Мануэлидис первой осуществила серийную передачу болезни Крейтцфельдта — Якоба (БКЯ) человека морским свинкам и мелким грызунам^[13][14][15]. Это позволило продемонстрировать фундаментальные механизмы инфекции. Был выявлен захват и распространение агента ТГЭ через миелоидные клетки крови^[16], что является общим путём для большинства вирусов. Отсутствие материнской передачи спорадической БКЯ (сБКЯ) у долгоживущих морских свинок^[17] противоречит гипотезе о наследовании сБКЯ по зародышевой линии. Как и в случае с вирусами, разные виды различаются по восприимчивости к конкретным штаммам агентов ТГЭ. Основные отличия штаммов от скрепи кодируются различными агентами ТГЭ человека, такими как сБКЯ, куру в Новой Гвинее^[18], связанная с коровами вБКЯ^[19] и азиатская БКЯ. Они были обнаружены и задокументированы в ходе экспериментальных передач нормальным мышам, хомякам и монотипичным клеточным культурам в Йельском университете. Полосы прионного белка не позволяют различить разные штаммы ТГЭ в стандартном мозге мыши.

Мануэлидис и её коллеги первыми показали с помощью лектинов, что амилоид прионного белка происходит от гликозилированного белка-предшественника массой 34 кДа. Антитела к PrP и выбранные лектины связывались с одним и тем же белком как в нормальных, так и в инфицированных БКЯ и скрепи фракциях мозга^[20]. Правильная углеводная последовательность PrP была впервые продемонстрирована в лаборатории Мануэлидис путём последовательного дегликозилирования и демаскирования углеводных остатков^[21]. Исследователи также разработали монотипичные клеточные культуры, инфицированные различными штаммами ТГЭ человека и овечьего скрепи. Были созданы быстрые количественные методы определения инфекционных титров с увеличением в миллион и более раз для каждого штамма^[22]. Как и в мозге, количество неправильно свёрнутого PrP увеличивается менее чем в 5 раз. Оно не позволяет различить даже более чем 100-кратные различия в инфекционности культивируемых штаммов агента. Исследования культур показали, что паттерны полос PrP зависят от типа клеток. Лишь редкие штаммы демонстрируют характерный паттерн фолдинга PrP в мозге или в монотипичных клетках. Изменение полос PrP не вызывает изменений характеристик штамма^[23]. Штаммы ТГЭ модифицируют репликацию друг друга вирусоподобным образом. Эксперименты на мышах и гипоталамических нейрональных клетках GT в культуре показывают как ингибирующую, так и аддитивную инфекционность двух разных штаммов ТГЭ. Один штамм ТГЭ может подавлять репликацию второго, более вирулентного штамма^[24], тогда как два разных штамма могут одновременно инфицировать клетки^[25].

Для многих штаммов ТГЭ были задокументированы резкие изменения времени удвоения агента (от недель до одного дня). Агенты ТГЭ реплицируются каждые 24 часа в культуре, что контрастирует с их медленной и штаммоспецифичной репликацией в мозге. Быстрая репликация агента в культуре, вероятно, связана с отсутствием ограничений со стороны сложной иммунной системы хозяина у животных^[22]. К таким ограничениям относятся ранние микроглиальные реакции^[26][27][28]. Амилоид PrP сам по себе может выступать в качестве защитного врождённого иммунного ответа на инфекцию агентом ТГЭ. Высокие уровни амилоида PrP способны уничтожить 99,999 % инфекционности^[29].