Эксклюзионная хроматография

Пространственно-эксклюзионная хроматография появилась в конце 1950-х и начале 1960-х годов, первоначально произведя революцию в анализе полимеров, обеспечив быстрое и надежное определение молекулярной массы. Первопроходцы, такие как Арчи Хамилек (Archie Hamielec), сыграли решающую роль в совершенствовании метода, улучшении обработки образцов и создании передовых методов для механизмов разделения и использования детекторов. Метод быстро завоевал популярность благодаря своей способности анализировать как синтетические, так и природные макромолекулы в умеренных, не денатурирующих условиях^[1].

В отличие от других методов хроматографии, пространственно — эксклюзионная хроматография представляет собой метод разделения, который зависит от относительного размера или гидродинамического объема макромолекулы по отношению к размеру и форме пор сорбента хроматографической колонки. С помощью высокопроизводительной пространственно — эксклюзионной хроматографии можно быстро определить относительное молекулярно-массовое распределение полимера. Если колонка откалибрована с использованием известных стандартов молекулярной массы, можно также получить средние значения молекулярной массы. Поскольку порядок элюирования является функцией от размера молекул, то метод пространственно — эксклюзионной хроматографии часто используется для идентификации сложных образцов, особенно компонентов с низкой молекулярной массой, а также для очистки образцов от компонентов с высокой молекулярной массой. Кроме того, с его помощью также можно определить конформацию молекул и степень ветвления длинноцепочечных соединений, в том числе биополимеров, при условии использования специальных масс-чувствительных детекторов (например, детекторы по светорассеянию и вискозиметрические)^[2].

Основными достоинствами метода являются: возможность работы как с органической, так и с водной фазой, возможность характеризации и разделения образцов в широком диапазоне молекулярных масс от 10² до 10⁷, высокая скорость разделения и высокое разрешение. Однако, как правило пространственно-эксклюзионная хроматография оказывается более дорогим методом (в сравнении с другими методами жидкостной хроматографии), часто требует специализированного оборудования способного обеспечивать работу системы при высоких температурах (более 100°C). Кроме того, суммарное число веществ разделяемых на колонках для пространственно-эксклюзионной хроматографии ограничено, так как ограничена нагрузочная ёмкость хроматографической колонки. В случае полимеров, для достижения наилучшего разрешения, требуется различие молекулярных масс компонентов по меньшей мере в 2 раза^[3]. Пространственно — эксклюзионная хроматография, к 2020 году является неотъемлемой частью анализа биофармацевтических продуктов, исследований агрегации белков, изучения наночастиц и исследований внеклеточных везикул. Совместимость метода с физиологическими условиями и универсальность типов образцов сделали его основой как в исследованиях, так и в промышленности^[4].

Существует несколько подходов к описанию механизма разделения в методе пространственно — эксклюзионной хроматографии.

Основная идея: Разделение происходит из-за разной доступности пор сорбента для молекул разного размера.

Механизм:

Крупные молекулы не проникают в поры и элюируются первыми. Малые молекулы проникают в поры, задерживаются и элюируются позже. Средние молекулы частично проникают, что приводит к промежуточному времени удерживания.

Математическое описание:

${\displaystyle V_{R}=V_{0}+K_{S}EC\cdot V_{P},}$

где:

V_R — удерживаемый объем,

V₀ — объем подвижной фазы вне пор,

V_P — объем пор сорбента,

K_SEC — коэффициент распределения (0 ≤ K_SEC ≤ 1).

Основная идея: Разделение обусловлено разной скоростью диффузии молекул в порах сорбента.

Механизм:

Малые молекулы диффундируют быстрее и глубже проникают в поры. Крупные молекулы имеют ограниченную диффузию и быстрее вымываются. Влияние параметров: Скорость потока элюента влияет на эффективность разделения. Вязкость растворителя изменяет диффузионные свойства.

Основная идея: Молекулы рассматриваются как сферы, проникающие в поры сорбента.

Механизм:

Вероятность проникновения зависит от соотношения размера молекулы и диаметра поры. Коэффициент распределения K выражается через функцию распределения пор.

Уравнение:

${\displaystyle K=\left(1-{\frac {R_{h}}{r_{p}}}\right)^{2},}$

где r_p — радиус поры.

Основная идея: Разделение зависит от гидродинамического радиуса молекул и их взаимодействия с потоком элюента.

Механизм: Крупные молекулы движутся преимущественно с потоком, минуя поры. Малые молекулы подвергаются турбулентному перемешиванию и задерживаются.

Основная идея: Разделение описывается термодинамическим равновесием между подвижной и неподвижной фазами.

Механизм: Распределение молекул зависит от их свободной энергии в порах и растворе. Энтропийные эффекты играют ключевую роль (большие молекулы исключаются из пор из-за потери конформационной энтропии).

Математическое описание:

${\displaystyle K=\exp \left(-{\frac {\Delta G}{RT}}\right),}$

где ΔG — изменение свободной энергии при переходе молекулы в пору.

В пространственно — эксклюзионной хроматографии расчеты удерживания и разрешения основаны на физических параметрах колонки и размерах молекул, а не на химических взаимодействиях. Ключевые особенности — ограниченный диапазон K_SEC​ и энтропийный механизм разделения, что требует особого подхода к оптимизации условий анализа.

Колонка для метода пространственно-эксклюзионной хроматографии согласно оценке Гиддингса ^[10] при полном разделении компонентов способна принять ограниченное число пиков, равное 20 (исходя из того, что нагрузочная ёмкость представлена числом пиков, а не массой образца). Разрешающая способность R_S, реализуемая в пространственно-эксклюзионной хроматографии, зависит от разделения пиков (ΔV_R) и от диспекрсии в колонке (δ_V):

${\displaystyle R_{S}={\frac {\Delta V_{R}}{4\delta _{V}}}}$

Факторы, влияющие на разрешение:

• Разделение пиков (ΔV_R​):
  • Зависит от объема колонки, размера пор наполнителя и конформации молекул.
• Дисперсия (δ_V):
  • Зависит от длины колонки, размера частиц, температуры и скорости потока подвижной фазы.

Удерживаемый объем (V_R​) рассчитывается по формуле:

${\displaystyle V_{R}=V_{0}+K_{s}V_{i},}$

где:

V₀ - межчастичный объем колонки (предел эксклюзии).

V_i - объем пор наполнителя (${\displaystyle V_{i}=V_{T}-V_{0},}$ где V_T - объем полного проникания).

K_S - коэффициент распределения, зависящий от доступного объема пор молекул (${\displaystyle K_{S}={\frac {V_{R}-V_{0}}{V_{T}-V_{0}}}}$), параметр ограничен диапазоном от 0 (полная эксклюзия) до 1 (полное проникание).

1. Основные компоненты SEC-системы

1. Хроматографическая система (ЖХ-система):

•     Насос – обеспечивает стабильный поток подвижной фазы (изократический режим, без градиента).
•     Инжектор – для ввода пробы (ручной или автоматический, например, автосемплер).
•     Детектор: рефрактометрический детектор, РИД, RI-detector (измеряет изменение показателя преломления); УФ-детектор, UVD, UV/Vis (для веществ, поглощающих УФ-свет); малопольный светорассеяния, МУР, MALS (для точного определения молекулярной массы), вязкозиметрический детектор (для анализа характеристической вязкости).2. SEC-колонки

    Гель-фильтрационные колонки (для водных растворов, например, серии TSK-Gel, Superdex).

    Гель-проникающие колонки (для органических растворителей, например, Styragel, PLgel).

3. Подвижная фаза (элюент)

    Для водных систем: буферные растворы (фосфатный, Tris-HCl) с добавками (NaCl для предотвращения неспецифических взаимодействий).

    Для органических систем: ТГФ (тетрагидрофуран), хлороформ, ДМФА.

Особые требования SEC: отсутствие градиента, так как SEC всегда работает в изократическом режиме, низкая скорость потока (обычно 0.5–1.0 мл/мин) для минимизации размывания пиков, калибровка колонки с использованием стандартов известной молекулярной массы (например, полистиролы для органических систем, белки для водных).

4. Применяемые стандарты

•     Полистиролы (для органической SEC).
•     Полиэтиленгликоли (ПЭГ), декстраны (для водной SEC).
•     Белковые стандарты (например, альбумин, цитохром С).

В колонку вносят раствор образца, объём которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объёма колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определённого диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объём удержания равен объёму колонки за вычетом объёма стационарной фазы (так называемый, свободный объём). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объём удержания несколько выше свободного объёма. Они элюируются вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объём удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объёму колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.

Гель — гетерогенная система, в которой подвижная фаза (обычно водная) всегда находится внутри пор стационарной или твёрдой фазы, называемой гелевой матрицей.

• агароза,
• декстран,
• полиакриламид,
• сефадекс,
• сефакрил,
• сефароза,
• супердекс.

• полиметакрилат,
• полистирол,
• силикагель