Спустя некоторое время министр внутренних дел П. А. Валуев выступил с предложением о создании университета в Николаеве, а одесский Ришельевский лицей преобразовать в Высшее техническое или сельскохозяйственное учебное заведение. Строганову и Пирогову удалось отстоять своё мнение. Летом 1861 года императору Александру II, который проезжал через Одессу, была представлена просьба об открытии здесь университета. Царь прислушался к просьбе, но разрешение о создании на базе Ришельевского лицея университета было дано лишь 10 (22) июня 1862 года. Между официальным разрешением и его реализацией прошло ещё три года; 1 (13) мая 1865 года попечителем округа А. А. Арцимовичем был торжественно открыт Императорский Новороссийский университет.
Первый учебный год начался 7 (19) сентября 1865 года. Новороссийский университет открылся в составе трёх факультетов: историко-филологического, физико-математического и юридического (наиболее многочисленного); на историко-филологическом был открыт 1 курс, на двух других ряд студентов были приняты на 2-й курс[3]. Кроме 174 студентов занятия посещали 58 вольнослушателей[4]. Первый выпуск состоялся в 1868 году; один из выпускников, Семён Ярошенко был удостоен золотой медали.
В 1900 году был основан четвёртый факультет — медицинский.
Практически с первого десятилетия существования Новороссийский университет стал флагманом науки и высшего образования, играл значительную роль в общественной жизни города и региона. Значительное место в учебной работе университета занимали учебно-вспомогательные учреждения — к 1897 году это были: преподавательская библиотека и студенческая библиотека, учреждённая Н. И. Пироговым и заключающая около 15 тысяч томов, Палеонтологический музей, Зоологический музей, Астрономическая обсерватория, Ботанический сад, Гидробиологическая станция, Музей изящных искусств;
Лаборатории и кабинеты: Историко-филологический кабинет (с 1887), Минцкабинет, Кабинет практической механики, Физический кабинет, Кабинет физической географии, Метеорологическая обсерватория (директор А. В. Клоссовский, издающий «Летопись» обсерватории), Химическая лаборатория, Технический кабинет с лабораторией, Агрономический кабинет с лабораторией, Минералогический кабинет, Геологический и Палеонтологический кабинет, Ботанический кабинет, Зоологический кабинет с лабораторией, Физиологический кабинет.
Активно действовали учёные общества при университете: Новороссийское общество естествоиспытателей (с 1870 года; его орган, «Записки», издавались с 1872 года), при нём математическое отделение — с 1876 года (также издавал свои «Записки»); Юридическое общество (1879—1884), Историко-филологическое общество при университете (с 1889), издающее «Летописи» общества, Одесское библиографическое общество. Члены учёных обществ университета принимали участие в организации и проведении отечественных и зарубежных научных съездов. При Новороссийском университете было два учёных съезда: естествоиспытателей (1883) и археологический (1884) и другие (статистический, сельскохозяйственный и проч.).