Спустя некоторое время министр внутренних дел П. А. Валуев выступил с предложением о создании университета в Николаеве, а одесский Ришельевский лицей преобразовать в Высшее техническое или сельскохозяйственное учебное заведение. Строганову и Пирогову удалось отстоять своё мнение. Летом 1861 года императору Александру II, который проезжал через Одессу, была представлена просьба об открытии здесь университета. Царь прислушался к просьбе, но разрешение о создании на базе Ришельевского лицея университета было дано лишь 10 (22) июня 1862 года. Между официальным разрешением и его реализацией прошло ещё три года; 1 (13) мая 1865 года попечителем округа А. А. Арцимовичем был торжественно открыт Императорский Новороссийский университет.
Первый учебный год начался 7 (19) сентября 1865 года. Новороссийский университет открылся в составе трёх факультетов: историко-филологического, физико-математического и юридического (наиболее многочисленного); на историко-филологическом был открыт 1 курс, на двух других ряд студентов были приняты на 2-й курс[3]. Кроме 174 студентов занятия посещали 58 вольнослушателей[4]. Первый выпуск состоялся в 1868 году; один из выпускников, Семён Ярошенко был удостоен золотой медали.
В 1900 году был основан четвёртый факультет — медицинский.
Практически с первого десятилетия существования Новороссийский университет стал флагманом науки и высшего образования, играл значительную роль в общественной жизни города и региона. Значительное место в учебной работе университета занимали учебно-вспомогательные учреждения — к 1897 году это были:
преподавательская библиотека и студенческая библиотека, учреждённая Н. И. Пироговым и заключающая около 15 тысяч томов,
Палеонтологический музей,
Зоологический музей,
Астрономическая обсерватория,
Ботанический сад,
Гидробиологическая станция,
Музей изящных искусств;
Лаборатории и кабинеты:
Историко-филологический кабинет (с 1887),
Минцкабинет,
Кабинет практической механики,
Физический кабинет, Кабинет физической географии,
Метеорологическая обсерватория (директор А. В. Клоссовский, издающий «Летопись» обсерватории),
Химическая лаборатория,
Технический кабинет с лабораторией,
Агрономический кабинет с лабораторией,
Минералогический кабинет,
Геологический и
Палеонтологический кабинет,
Ботанический кабинет,
Зоологический кабинет с лабораторией,
Физиологический кабинет.
Активно действовали учёные общества при университете:
Новороссийское общество естествоиспытателей (с 1870 года; его орган, «Записки», издавались с 1872 года), при нём математическое отделение — с 1876 года (также издавал свои «Записки»);
Юридическое общество (1879—1884),
Историко-филологическое общество при университете (с 1889), издающее «Летописи» общества,
Одесское библиографическое общество.
Члены учёных обществ университета принимали участие в организации и проведении отечественных и зарубежных научных съездов. При Новороссийском университете было два учёных съезда: естествоиспытателей (1883) и археологический (1884) и другие (статистический, сельскохозяйственный и проч.).