АссистентНовый вопросИсторияОбласти знаний
Партнёрские проектыСпецпроектыСтать автором
Сменить язык
О РУВИКИ

Эксклюзионная хроматография

Гель-фильтрация или эксклюзионная хроматография (ситовая, гель-проникающая, гель-фильтрационная хроматография) — разновидность хроматографии, в ходе которой молекулы веществ разделяются по размеру за счёт их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми выходят из колонки наиболее крупные молекулы (бо́льшей молекулярной массы), способные проникать в минимальное число пор стационарной фазы. Последними выходят вещества с малыми размерами молекул, свободно проникающие в поры. В отличие от адсорбционной хроматографии, при гель-фильтрации стационарная фаза остаётся химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует.

Пространственно-эксклюзионная хроматография (SEC, от англ. size exclusion chromatography) — это метод жидкостной хроматографии, используемый для разделения молекул по их гидродинамическому радиусу или объему. Размер в растворе зависит от молекулярной массы, формы и степени сольватации[1].

В методе объединяются подходы используемые в гель-фильтрационной хроматографии (GFC, от англ. gel filtration chromatography) для работы с сильнополярными фазами (преимущественно водными) и гель-проникающая хроматография (GPC, от англ. gel penetration chromatography) для работы с органическими подвижными фазами. Метод разделения даёт хорошо предсказуемые результаты для образцов компоненты в которых достаточно различимы по размеру, что делает его идеально пригодным для изучения полимеров[1].

История

Пространственно-эксклюзионная хроматография появилась в конце 1950-х и начале 1960-х годов, первоначально произведя революцию в анализе полимеров, обеспечив быстрое и надежное определение молекулярной массы. Первопроходцы, такие как Арчи Хамилек (Archie Hamielec), сыграли решающую роль в совершенствовании метода, улучшении обработки образцов и создании передовых методов для механизмов разделения и использования детекторов. Метод быстро завоевал популярность благодаря своей способности анализировать как синтетические, так и природные макромолекулы в умеренных, не денатурирующих условиях[1].

Предназначение метода

В отличие от других методов хроматографии, пространственно — эксклюзионная хроматография представляет собой метод разделения, который зависит от относительного размера или гидродинамического объема макромолекулы по отношению к размеру и форме пор сорбента хроматографической колонки. С помощью высокопроизводительной пространственно — эксклюзионной хроматографии можно быстро определить относительное молекулярно-массовое распределение полимера. Если колонка откалибрована с использованием известных стандартов молекулярной массы, можно также получить средние значения молекулярной массы. Поскольку порядок элюирования является функцией от размера молекул, то метод пространственно — эксклюзионной хроматографии часто используется для идентификации сложных образцов, особенно компонентов с низкой молекулярной массой, а также для очистки образцов от компонентов с высокой молекулярной массой. Кроме того, с его помощью также можно определить конформацию молекул и степень ветвления длинноцепочечных соединений, в том числе биополимеров, при условии использования специальных масс-чувствительных детекторов (например, детекторы по светорассеянию и вискозиметрические)[2].

Основными достоинствами метода являются: возможность работы как с органической, так и с водной фазой, возможность характеризации и разделения образцов в широком диапазоне молекулярных масс от 102 до 107, высокая скорость разделения и высокое разрешение. Однако, как правило пространственно-эксклюзионная хроматография оказывается более дорогим методом (в сравнении с другими методами жидкостной хроматографии), часто требует специализированного оборудования способного обеспечивать работу системы при высоких температурах (более 100°C). Кроме того, суммарное число веществ разделяемых на колонках для пространственно-эксклюзионной хроматографии ограничено, так как ограничена нагрузочная ёмкость хроматографической колонки. В случае полимеров, для достижения наилучшего разрешения, требуется различие молекулярных масс компонентов по меньшей мере в 2 раза[3]. Пространственно — эксклюзионная хроматография, к 2020 году является неотъемлемой частью анализа биофармацевтических продуктов, исследований агрегации белков, изучения наночастиц и исследований внеклеточных везикул. Совместимость метода с физиологическими условиями и универсальность типов образцов сделали его основой как в исследованиях, так и в промышленности[4].

Механизм разделения

Существует несколько подходов к описанию механизма разделения в методе пространственно — эксклюзионной хроматографии.

1. Теория эксклюзионного объема (Steric Exclusion Theory)[5]

Основная идея: Разделение происходит из-за разной доступности пор сорбента для молекул разного размера.

Механизм:

Крупные молекулы не проникают в поры и элюируются первыми. Малые молекулы проникают в поры, задерживаются и элюируются позже. Средние молекулы частично проникают, что приводит к промежуточному времени удерживания.

Математическое описание:

где:

VR — удерживаемый объем,

V0 — объем подвижной фазы вне пор,

VP — объем пор сорбента,

KSEC — коэффициент распределения (0 ≤ KSEC ≤ 1).

2. Теория ограниченной диффузии (Restricted Diffusion Theory)[6]

Основная идея: Разделение обусловлено разной скоростью диффузии молекул в порах сорбента.

Механизм:

Малые молекулы диффундируют быстрее и глубже проникают в поры. Крупные молекулы имеют ограниченную диффузию и быстрее вымываются. Влияние параметров: Скорость потока элюента влияет на эффективность разделения. Вязкость растворителя изменяет диффузионные свойства.

3. Модель "проникающей сферы" (Permeable Sphere Model)[7]

Основная идея: Молекулы рассматриваются как сферы, проникающие в поры сорбента.

Механизм:

Вероятность проникновения зависит от соотношения размера молекулы и диаметра поры. Коэффициент распределения K выражается через функцию распределения пор.

Уравнение:

где rp — радиус поры.

4. Гидродинамическая теория (Hydrodynamic Theory)[8]

Основная идея: Разделение зависит от гидродинамического радиуса молекул и их взаимодействия с потоком элюента.

Механизм: Крупные молекулы движутся преимущественно с потоком, минуя поры. Малые молекулы подвергаются турбулентному перемешиванию и задерживаются.

5. Термодинамическая теория (Thermodynamic Partition Theory)[9]

Основная идея: Разделение описывается термодинамическим равновесием между подвижной и неподвижной фазами.

Механизм: Распределение молекул зависит от их свободной энергии в порах и растворе. Энтропийные эффекты играют ключевую роль (большие молекулы исключаются из пор из-за потери конформационной энтропии).

Математическое описание:

где ΔG — изменение свободной энергии при переходе молекулы в пору.

Расчеты разрешения и удерживания

В пространственно — эксклюзионной хроматографии расчеты удерживания и разрешения основаны на физических параметрах колонки и размерах молекул, а не на химических взаимодействиях. Ключевые особенности — ограниченный диапазон KSEC​ и энтропийный механизм разделения, что требует особого подхода к оптимизации условий анализа.

Расчет разрешающей способности (Rs)

Колонка для метода пространственно-эксклюзионной хроматографии согласно оценке Гиддингса [10] при полном разделении компонентов способна принять ограниченное число пиков, равное 20 (исходя из того, что нагрузочная ёмкость представлена числом пиков, а не массой образца). Разрешающая способность RS, реализуемая в пространственно-эксклюзионной хроматографии, зависит от разделения пиков (ΔVR) и от диспекрсии в колонке (δV):

Факторы, влияющие на разрешение:

  • Разделение пиков (ΔVR​):
    • Зависит от объема колонки, размера пор наполнителя и конформации молекул.
  • Дисперсия (δV):
    • Зависит от длины колонки, размера частиц, температуры и скорости потока подвижной фазы.
Удерживание (ΔVR)

Удерживаемый объем (VR​) рассчитывается по формуле:

где:

V0 - межчастичный объем колонки (предел эксклюзии).

Vi - объем пор наполнителя ( где VT - объем полного проникания).

KS - коэффициент распределения, зависящий от доступного объема пор молекул (), параметр ограничен диапазоном от 0 (полная эксклюзия) до 1 (полное проникание).

Оборудование для пространственно - эксклюзионной хроматографии

1. Основные компоненты SEC-системы

  1. Хроматографическая система (ЖХ-система):
  •     Насос – обеспечивает стабильный поток подвижной фазы (изократический режим, без градиента).
  •     Инжектор – для ввода пробы (ручной или автоматический, например, автосемплер).
  •     Детектор: рефрактометрический детектор, РИД, RI-detector (измеряет изменение показателя преломления); УФ-детектор, UVD, UV/Vis (для веществ, поглощающих УФ-свет); малопольный светорассеяния, МУР, MALS (для точного определения молекулярной массы), вязкозиметрический детектор (для анализа характеристической вязкости).2. SEC-колонки

    Гель-фильтрационные колонки (для водных растворов, например, серии TSK-Gel, Superdex).

    Гель-проникающие колонки (для органических растворителей, например, Styragel, PLgel).

3. Подвижная фаза (элюент)

    Для водных систем: буферные растворы (фосфатный, Tris-HCl) с добавками (NaCl для предотвращения неспецифических взаимодействий).

    Для органических систем: ТГФ (тетрагидрофуран), хлороформ, ДМФА.

Особые требования SEC: отсутствие градиента, так как SEC всегда работает в изократическом режиме, низкая скорость потока (обычно 0.5–1.0 мл/мин) для минимизации размывания пиков, калибровка колонки с использованием стандартов известной молекулярной массы (например, полистиролы для органических систем, белки для водных).

4. Применяемые стандарты

  •     Полистиролы (для органической SEC).
  •     Полиэтиленгликоли (ПЭГ), декстраны (для водной SEC).
  •     Белковые стандарты (например, альбумин, цитохром С).

Принцип

В колонку вносят раствор образца, объём которого является лимитирующим для качества хроматографии. Для аналитических разделений он не должен превышать 0,1 % от CV (общего объёма колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10 % от CV. Колонка упакована порошком, частицы или гранулы которого имеют поры определённого диаметра. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры, проходят между гранулами, поэтому их объём удержания равен объёму колонки за вычетом объёма стационарной фазы (так называемый, свободный объём). Они элюируются первыми. Молекулы средних размеров помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объём удержания несколько выше свободного объёма. Они элюируются вторыми. Самые мелкие молекулы свободно входят в поры вместе с молекулами растворителя. Поэтому их объём удержания в колонке намного выше свободного и приближается к общему объёму колонки (то есть 100 % CV). Они элюируются последними.

Сорбенты

Гель — гетерогенная система, в которой подвижная фаза (обычно водная) всегда находится внутри пор стационарной или твёрдой фазы, называемой гелевой матрицей.

Низкого давления

Высокого давления

Примечания

  1. ↑ 1 2 3 Neil T. McManus. Author response for "A retrospective look at developments in size exclusion chromatography from the early Hamielec research era to the present day". — 2023-05-15. — doi:10.1002/cjce.25013/v2/response1.
  2. ↑ André M. Striegel. Size-Exclusion Chromatography: A Twenty-First Century Perspective // Chromatographia. — 2022-03-28. — Т. 85, вып. 4. — С. 307–313. — ISSN 1612-1112 0009-5893, 1612-1112. — doi:10.1007/s10337-022-04143-1.
  3. ↑ А.Я. Яшин, Я.И. Яшин, В.В. Родченкова. Высокотемпературная высокоэффективная жидкостная хроматография. Краткий обзор // ANALYTICS Russia. — 2021-08-25. — Т. 11, вып. 4. — С. 316–322. — ISSN 2227-572X. — doi:10.22184/2227-572x.2021.11.4.316.322.
  4. ↑ Valentina D’Atri, Mateusz Imiołek, Colette Quinn, Abraham Finny, Matthew Lauber, Szabolcs Fekete, Davy Guillarme. Size exclusion chromatography of biopharmaceutical products: From current practices for proteins to emerging trends for viral vectors, nucleic acids and lipid nanoparticles // Journal of Chromatography A. — 2024-05. — Т. 1722. — С. 464862. — ISSN 0021-9673. — doi:10.1016/j.chroma.2024.464862.
  5. ↑ William S. Hlavacek, Richard G. Posner, Alan S. Perelson. Steric Effects on Multivalent Ligand-Receptor Binding: Exclusion of Ligand Sites by Bound Cell Surface Receptors // Biophysical Journal. — 1999-06. — Т. 76, вып. 6. — С. 3031–3043. — ISSN 0006-3495. — doi:10.1016/s0006-3495(99)77456-4.
  6. ↑ Mohsen Moussaoui, Mohamed Benlyas, Philippe Wahl. Diffusion of proteins in the chromatographic gel AcA-34 // Journal of Chromatography A. — 1991-09. — Т. 558, вып. 1. — С. 71–80. — ISSN 0021-9673. — doi:10.1016/0021-9673(91)80112-t.
  7. ↑ A.A. Gorbunov, A.M. Skvortsov. Separating power of gel permeation chromatography // Polymer Science U.S.S.R.. — 1990-01. — Т. 32, вып. 3. — С. 567–574. — ISSN 0032-3950. — doi:10.1016/0032-3950(90)90148-y.
  8. ↑ Takeshi Fukuda, Noriyuki Kohara, Yoshihiko Onogi, Hiroshi Inagaki. Separation of simple ions by gel chromatography // Journal of Chromatography A. — 1990. — Т. 511. — С. 59–68. — ISSN 0021-9673. — doi:10.1016/s0021-9673(01)93270-4.
  9. ↑ Paul L. Dubin, Raima M. Larter, Christine J. Wu, Jerome I. Kaplan. Size-exclusion chromatography of polyelectrolytes: comparison with theory // The Journal of Physical Chemistry. — 1990-09. — Т. 94, вып. 18. — С. 7243–7250. — ISSN 1541-5740 0022-3654, 1541-5740. — doi:10.1021/j100381a053.
  10. ↑ I. W. Wainer W. J. Lough. High Performance Liquid Chromatography: Fundamental Principles and Practice. — CRC Press. — С. 189. — 276 с. — ISBN 978-0751400762.

Категории