Фингерпринтинг сообществ

T-RFLP — метод, использующий флуоресцентно-меченые фрагменты ДНК для получения фингерпринта сообщества^[2][7].

Для проведения T-RFLP (рис. 1) необходимо выбрать целевой ген (например, ген 16S рРНК) для амплификации методом ПЦР. По крайней мере один из праймеров, используемых в реакции ПЦР, флуоресцентно мечен на 5′-конце. После амплификации ПЦР каждая копия ДНК несёт флуоресцентную метку. Затем амплифицированная ДНК разрезается с помощью рестриктаз в определённых сайтах узнавания. Предполагается, что у каждого микроба в образце последовательность целевого гена различается, поэтому рестриктаза разрезает ДНК каждого микроба в уникальном месте. (Каждый уникальный сайт рестрикции считается отдельной оперативной таксономической единицей — OTU.) Таким образом, фермент образует фрагмент определённой длины для каждого типа микроба, присутствующего в образце. В результате получается набор рестрикционных фрагментов разной длины, каждый из которых мечен флуоресцентной меткой на одном конце. Эти фрагменты называются «терминальными», поскольку метка находится на том конце, где был присоединён ПЦР-праймер. (Немеченые концы не учитываются в итоговом анализе.) Далее фрагменты разделяют по размеру с помощью гель-электрофореза или капиллярного электрофореза. Лазерный детектор фиксирует размер и интенсивность флуоресценции терминальных фрагментов. В анализ включают ДНК-стандарты известного размера и интенсивности флуоресценции для калибровки. Установка минимального порога флуоресценции позволяет исключить фоновый шум^[4].

Результатом лазерного детектирования является электроферограмма, на которой отображается серия пиков: по горизонтальной оси — длина фрагмента, по вертикальной — интенсивность флуоресценции (рис. 1). Вторым результатом^[4] является таблица данных, в которой указано время миграции фрагментов, размер каждого пика в парах оснований, а также высота и площадь каждого пика.

Теоретически предполагается, что пики в разных положениях по горизонтальной оси соответствуют разным типам организмов (или OTU). Площадь под каждым пиком интенсивности флуоресценции служит косвенной мерой относительной численности каждого филотипа в сообществе. Однако необходимо учитывать ряд оговорок. Разные типы организмов могут иметь одинаковый сайт рестрикции в исследуемом гене; в этом случае они не будут различимы как отдельные пики на электроферограмме. Кроме того, площадь под пиком отражает относительную, а не абсолютную численность, и существуют искажения при измерении численности и амплификации ПЦР. Например, организмы, малочисленные в исходной пробе ДНК, могут быть недостаточно амплифицированы для обнаружения в итоговом анализе^[7]. Это приводит к недооценке разнообразия сообщества. Лию и соавторы^[7] отмечают и другие возможные факторы искажения результатов, включая «различия в числе копий гена между видами и искажения, возникающие при лизисе клеток, экстракции ДНК и амплификации ПЦР» (стр. 4521). Для получения более подробной технической информации Марш^[2] приводит перечень возможных источников искажений на каждом этапе процесса T-RFLP.

Основные преимущества T-RFLP — быстрота и возможность одновременного анализа большого числа образцов^[2]. Кроме того, визуальный результат облегчает сравнение структуры сообществ между разными образцами. Недостатком является общий, качественный характер получаемых данных, которые необходимо интерпретировать с учётом вышеуказанных оговорок. Также с помощью T-RFLP невозможно напрямую идентифицировать микробы в образце.

Дисаятануват и соавторы^[8] использовали T-RFLP для оценки микробного сообщества кишечника, или микробиома, у двух видов медоносных пчёл в Таиланде. Было установлено, что эти виды имеют различные микробные сообщества, а микробиом меняется в течение жизни пчёл.

Джу и соавторы^[9] протестировали T-RFLP как метод мониторинга фитопланктона. Авторы собирали пробы воды из водохранилищ в виде временного ряда. Сравнив образцы с известными терминальными рестрикционными фрагментами (из базы данных, построенной на культурах), они пришли к выводу, что T-RFLP может эффективно использоваться для отслеживания изменений в сообществе фитопланктона. Однако оценки разнообразия и численности оказались менее точными по сравнению с другими методами.

ДГГЭ — это метод фингерпринтинга микробных сообществ, который разделяет ампликоны примерно одинакового размера по особенностям их последовательности^[1]. Эти особенности определяют порог, при котором ДНК денатурирует. Гель ДГГЭ содержит градиент денатурирующего агента (смесь мочевины и формамида) или линейный температурный градиент^[10]. Когда фрагмент достигает своей точки плавления (порогового значения денатурирующего агента), он перестаёт мигрировать. Это связано с тем, что частично расплавленная двухцепочечная ДНК больше не может перемещаться по гелю^[11]. В качестве специального праймера используется GC-зажим (около 40 оснований с высоким содержанием GC), который «якорит» фрагменты ПЦР после их денатурации^[12].

Каждая дорожка на геле соответствует одному микробному сообществу. Совпадающие полосы между образцами имеют одинаковый размер и примерно одинаковое положение на геле. Варианты гена, которые не совпадают между образцами микробных сообществ, не выстраиваются горизонтально с другими. Например, если исследуемый ген — 16S рРНК, как это было при первом описании метода, то амплифицированные ПЦР-фрагменты будут находиться на одной вертикали, поскольку имеют примерно одинаковый размер^[13]. Другой целевой ген может иметь большую вариабельность длины, но градиент денатурирующего агента позволяет дополнительно различать образцы по точке плавления. Гель ДГГЭ разделяет гены одинакового размера по их нуклеотидной последовательности.

Этот метод позволяет оценить степень сходства или различия микробных сообществ по таксономическому составу. Каждая полоса в разном положении на геле соответствует отдельному филотипу (уникальной последовательности филогенетического маркёрного гена)^[1]. Для микробных сообществ этот метод профилирует множество индивидуальных последовательностей 16S рРНК^[14]. Количество полос на разных горизонтальных позициях можно использовать для оценки уровня биоразнообразия в образце и для вывода о филогенетической принадлежности^[10]. Для получения более точной информации о филогенетической принадлежности можно вырезать интересующие полосы из геля и секвенировать их.

Использование денатурирующего профиля позволяет разделять фрагменты ДНК схожего размера. Это полезно для оценки микробного разнообразия, поскольку ген 16S рРНК мало варьирует по размеру между бактериальными типами. Гель ДГГЭ позволяет быстро оценить биоразнообразие микробного образца и не исключает возможности секвенирования интересующих полос. Метод не требует культивирования микробов в лаборатории и не нуждается в данных о последовательностях для проектирования зондов для гибридизации^[10]. Основной недостаток — качественный характер оценки биоразнообразия; для выводов о филогенетическом родстве необходимо секвенировать гены. Другой недостаток — вариабельность GC-зажима при каждом синтезе, что может приводить к разным профилям ДГГЭ для одной и той же последовательности 16S рРНК^[12].

Стивен и соавторы^[15] использовали ДГГЭ для быстрого анализа протеобактерий в почве. Они получили первоначальную оценку микробного разнообразия в пробах почвы, поддерживаемых в течение 36 лет при различных значениях pH. Авторы объединили ДГГЭ и гибридизационные методы, используя зондирование ДНК-фрагментов для получения более подробной информации о природных популяциях. В исследовании рассматривалась группа близкородственных типов бактерий — все автотрофные β-протеобактериальные аммиак-окислители. Пробы 16S рДНК дали неясные перекрывающиеся полосы при электрофорезе. Эти полосы были разделены с помощью кластер-специфических радиомеченых зондов, что позволило получить данные о относительной численности различных генотипов в образцах.

Уорд и соавторы^[14] исследовали цианобактериальные маты в горячем источнике Йеллоустоуна с помощью анализа ДГГЭ фрагментов гена 16S рРНК аэробных хемоорганотрофных популяций. ДГГЭ позволил им получить профиль сообщества и новые сведения о разнообразии. Интересующие полосы были охарактеризованы путём очистки и секвенирования, что позволило выявить многие ранее неизвестные линии.

(Автоматизированный) ARISA (рис. 3) использует тот факт, что в ДНК прокариот закодированы два высококонсервативных гена — ген 16S рРНК и ген 23S рРНК. Они кодируют малую и большую субъединицы рРНК в опероне. Между этими двумя генами находится внутренний транскрибируемый спейсер (ITS). Поскольку он не кодирует белки, его нуклеотидная последовательность и длина сильно варьируют. После выделения ДНК из сообщества ПЦР амплифицирует этот спейсерный участок. Фрагменты можно разделить на геле (RISA) или перевести флуоресцентные праймеры в пики на электроферограмме (ARISA), отражающие относительную численность фрагментов разной длины^[16][17].

Из-за вариабельности некодирующих участков результатом RISA является гель с различными полосами, а результатом ARISA — электроферограмма с разными пиками (аналогично T-RFLP).

Яркость флуоресцентно меченых праймеров коррелирует с распространённостью данного типа бактерий в сообществе. Полосы на геле можно интерпретировать как специфический для сообщества профиль. Каждая полоса или пик ДНК указывает на наличие по крайней мере одного представителя данного организма^[16]. В RISA полосы на геле, не совпадающие по длине, соответствуют разным организмам, поскольку у них различаются спейсерные участки между двумя консервативными генами. Электроферограмма показывает пики, соответствующие относительной численности данного спейсерного участка в образце.

ARISA может иметь более высокое разрешение при обнаружении микробного разнообразия по сравнению с T-RFLP^[18]. Этот метод фингерпринтинга позволяет быстро и чувствительно оценить микробное разнообразие. Обнаруженные различия в длине фрагментов можно сравнивать с базами данных для поиска совпадений с культивируемыми организмами^[16]. Можно разрабатывать праймеры для олигонуклеотидов на уровне типа для изучения филогенетических групп^[16]. Недостатком ARISA является то, что один организм может давать несколько пиков в профиле сообщества. Несвязанные организмы также могут иметь схожую длину спейсеров, что приводит к недооценке разнообразия. В связи с этими искажениями исследователи часто используют этот метод на нескольких пробах из каждого сообщества для получения усреднённой оценки.

Раньярд и соавторы^[17] приводят примеры исследований, в которых использовался метод RISA для фингерпринтинга бактериальных сообществ после таких воздействий, как лечение антибиотиками, стресс от ртути и вырубка леса. Также они продемонстрировали успешное применение ARISA для характеристики грибных сообществ, что остаётся малоизученным аспектом микробной экологии.

Шлосс и соавторы^[19] провели исследование, в котором изучали влияние факторов окружающей среды и связывали их с изменениями микробной экологии компостной кучи. Они использовали ARISA для профилирования структуры сообщества и отслеживания микробной сукцессии на разных стадиях компостирования. Были взяты пробы ДНК и секвенирован ген 16S рРНК для идентификации членов сообщества на разных этапах процесса. Затем с помощью ARISA анализировали изменения на уровне всего сообщества и сопоставляли последовательности гена 16S рРНК с наиболее распространёнными фрагментами ARISA для идентификации этих членов микробного сообщества.