Синтез пептидов

Зарождение химии пептидов принято отсчитывать с 1901 года, когда Эмиль Фишер и Эрнст Фуртмайер впервые получили дипептид глицилглицин путём неполного гидролиза белкового экстракта. Фишеру не удалось добиться селективного наращивания цепи — его метод приводил к смеси олигомеров разной длины^[2]. Решающий вклад в решение этой проблемы внёс немецкий химик Макс Бергман, который в 1930-х годах разработал первые защитные группы (карбобензокси-группу) и методы активации карбоксильной группы.

В 1963 году Роберт Брюс Меррифилд предложил методику твердофазного синтеза (SPPS). Идея заключалась в закреплении первого аминокислотного остатка на нерастворимом полимерном носителе. Сборка цепи происходила при последовательной обработке смолы растворами активированных аминокислот и реагентами для снятия защиты — избыток реагентов легко удалялся фильтрованием и промывкой. Этот метод, обеспечивший Меррифилду Нобелевскую премию по химии 1984 года, позволил автоматизировать процесс и сократить время синтеза белка с месяцев до нескольких дней^[3].

В последующие десятилетия были разработаны альтернативные схемы защиты, такие как Fmoc-стратегия (предложена Карпентером и Ханом в 1970 году), а также методы параллельного и конвергентного синтеза, что привело к организации высокопроизводительного автоматического пептидного синтеза в промышленных масштабах.

Синтез пептидов в растворе (LPPS, liquid-phase peptide synthesis), разработанный Э. Фишером. Этот метод включает последовательное наращивание цепи с временной защитой функциональных групп. Недостаток метода — трудоёмкость очистки промежуточных продуктов, что делает его малоэффективным для получения длинных пептидов^[4].

Революцию в области синтеза пептидов совершил американский биохимик Роберт Брюс Меррифилд (Нобелевская премия, 1984), предложивший в 1963 году метод твёрдофазного синтеза^[5]. Идея заключается в закреплении первого аминокислотного остатка на нерастворимом полимерном носителе (полистирол-дивинилбензол). Наращивание цепи происходит в реакторе, где избыток реагентов и побочные продукты легко удаляются фильтрацией. В 1969 году Меррифилд с сотрудниками синтезировал фермент рибонуклеазу A (124 остатка), что стало оказательством эффективности метода^[6][9]. Автоматизация твёрдофазного синтеза позволила резко сократить время синтеза: например, получение инсулина (51 остаток) стало возможным за 20 дней вместо нескольких месяцев.

В настоящее время доминирует метод твёрдофазного пептидного синтеза с использованием 9-флуоренилметоксикарбонильной группы (SPPS) для временной защиты аминогрупп^[7]. Наряду с классическим периодическим синтезом активно развивается непрерывный проточный синтез, позволяющий получать пептиды длиной более 200 остатков и осуществлять GMP-производство в килограммовых масштабах^[8][9].

Для получения больших белков и циклических пептидов применяют методы конвергентного синтеза и лигирования — соединения незащищённых пептидных фрагментов. Активно развиваются методы «зелёной химии», направленные на снижение расхода растворителей (особенно диметилформамида), а также электрохимические и фотохимические методы катализа^[10].

Синтез пептидов остаётся одной из наиболее динамично развивающихся областей биоорганической химии, интегрируя достижения автоматизации, вычислительной химии и биоконъюгации^[11].

• Синтезаторы перистальтического типа. Реагенты подаются через трубки под давлением инертного газа. Эти системы отличаются высокой надёжностью и позволяют работать с масштабами от 0,01 до 5 ммоль. Основной недостаток — значительный расход реагентов на промывку коммуникаций.
• Синтезаторы с микрофлюидными чипами. Представляют собой чипы с системой каналов микронного размера. Позволяют работать с наномолярными количествами реагентов, что критически важно для синтеза чрезвычайно дорогих пептидов (например, меченных радиоактивными изотопами)^[12].

• Реакторы для твердофазного синтеза представляют собой стеклянные или полипропиленовые колонки с пористой стеклянной фриттой, обеспечивающей фильтрацию раствора без потери полимерной смолы. Для ручного синтеза используются шприцевые колонки или флаконы на орбитальных шейкерах [4].
• Системы препаративной ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) — элемент конечной очистки. Современные препаративные ВЭЖХ-системы работают при давлении до 400 бар и оснащены УФ-детекторами с переменной длиной волны [6].
• Масс-спектрометры используются для контроля качества на каждом этапе синтеза. Они позволяют подтвердить молекулярную массу синтезированного пептида и выявить наличие коротких последовательностей.